Contrôle de l’activité d’une Glucose-6-phosphate-déshydrogénase (G6PDH) utilisée dans un test urinaire détectant le tétrahydrocannabinol (THC) publié le 20/06/2023  - mis à jour le 29/06/2023

Partie pratique
L’objectif de cette activité technologique est de vérifier le bon fonctionnement de l’enzyme conjugué et la neutralisation de son activité par des anticorps anti-THC. Pour cela, il faut déterminer l’activité de la G6PDH conjuguée en présence et en absence d’anticorps anti-THC que l’on compare à l’activité d’une solution de G6PDH non conjuguée.

Matériel et réactifs
Poste unique pour l’ensemble des candidats (passage individuel) :

• Solution réactionnelle 1 : NAD+ - Tampon Tris pH8 - MgCl2 : 1 mL x 3
• Solution réactionnelle 2 : Solution de glucose-6-P à 0,6 mmol/L : 1 mL x 3
• Solution de glucose-6-phosphate déshydrogénase native (G6PDH native) : 0,1 mL
• Solution de glucose-6-phosphate déshydrogénase conjugué (G6PDH conjugué) : 0,1 mLx2
• Solution d’anticorps anti-THC : 0,9 mL
• Solution Tampon Tris pH8 : 0,9 mL x 2
• 3 cuves spectrophotométriques
• Pipettes automatiques P5000 – P1000 – P200
• Spectrophotomètre
• Logiciel de cinétique (Lag time 30 secondes ; Duration 150 secondes)

Procédure opératoire
Réaliser dans les cuves les 3 cinétiques suivantes à température ambiante. Réaliser les enregistrements en overlay (les 3 enregistrements sur le même graphique) :

• Cinétique 1 :
  Introduire dans une cuve :
  - 1 mL de solution réactionnelle 1
  - 0,9 mL de tampon Tris pH8.
  - 0,1 mL de G6PDH native
  Déclencher la réaction en introduisant dans la cuve 1 mL de solution réactionnelle 2.
  Mélanger et suivre la variation d’absorbance à 340 nm pendant deux minutes.

• Cinétique 2 :
  Introduire dans une cuve :
  - 1 mL de solution réactionnelle 1
  - 0,9 mL de tampon Tris pH8.
  - 0,1 mL de G6PDH conjugué
  Déclencher la réaction en introduisant dans la cuve 1 mL de solution réactionnelle 2.
  Mélanger et suivre la variation d’absorbance à 340 nm pendant deux minutes.

• Cinétique 3 :
  Introduire dans une cuve :
  - 1 mL de solution réactionnelle 1
  - 0,9 mL de solution d’anticorps anti-THC
  - 0,1 mL de G6PDH conjugué
  Déclencher la réaction en introduisant dans la cuve 1 mL de solution réactionnelle 2.
  Mélanger et suivre la variation d’absorbance à 340 nm pendant deux minutes.

Questionnement

• Rassembler dans le tableau ci-dessous les valeurs de ∆A/∆t (en min^-1) obtenues.
• Calculer les concentrations d’activités catalytiques à l’aide de l’équation aux grandeurs suivantes :
  

Avec : V_MR = volume du milieu réactionnel en mL et E_enz= volume d’enzyme en mL

• Compléter le tableau avec vos valeurs calculées.

• Conclure à propos de l’influence de la présence du THC sur l’enzyme et sur l’efficacité de l’anticorps pour la réalisation du test urinaire.