Mallette FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) publié le 13/09/2016

Extraction et purification du lysozyme du blanc d'oeuf

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4. Mesure de l’activité enzymatique

4.1 Mode opératoire

  • Opérer en cuve de spectrophotomètre, si possible à 25°C
  • Introduire :
    • 2,9 mL de substrat (suspension de parois de Micrococcus à 200mg/L)
    • 0,1 mL de fraction enzymatique
  • Trois fractions sont testées préalablement diluées comme suit :
    Tableau des dilutions pour les différentes fractions
  • la variation d’absorbance à 450 nm pendant 2 à 3 min et déterminer le A/min

L’activité catalytique du lysozyme est mesurée par diminution de l’absorbance à 450 nm d’une suspension bactérienne de Micrococcus lysodeikticus à pH 6,24. Une unité d’activité enzymatique est définie comme étant la quantité d’enzyme qui provoque une variation d’absorbance de 0,001 par minute dans les conditions de l’expérience et à 25°C.

4.2 Dosage colorimétrique des protéines (par FOLIN-LOWRY)

  • Réalisation de la gamme d’étalonnage :
    • A l’aide d’une solution de protéine étalon (SAB) à 0,5 g.L-1, réaliser une gamme 6 tubes contenant au maximum 1 mL de solution de protéine étalon.
    • Ajouter dans chaque tube 5 mL de réactif de LOWRY et agiter et attendre 10 minutes
    • Ajouter dans chaque tube 0,5 mL de réactif de FOLIN, puis agiter immédiatement et laisser la coloration se développer 30 minutes à l’obscurité, à température ambiante.
    • Mesurer l’absorbance à 650 nm contre un témoin réactif.
  • Dosage des protéines :
    Réaliser, selon le même protocole que la gamme étalon, le dosage des fractions SBO, P1 et P2.

Les éventuelles dilutions seront réalisées en eau physiologique. Une estimation des protéines présentes peut être réalisée par l’intégration des pics obtenus en chromatographie