Mallette FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) publié le 13/09/2016

3. Extraction et purification du lysozyme du blanc d’œuf

3.1 Généralités

Le lysozyme EC. 3.2.1.17, catalyse l’hydrolyse des liaisons β(1-4) osidiques entre l’acide N-acétylmuramique et la N-acétylglucosamine du peptidoglycane des parois bactériennes.
Cette hydrolyse de la couche rigide de la paroi provoque la lyse des cellules en milieu hypotonique. Le lysozyme, découvert en 1929 par Fleming dans les larmes, est également présent dans le blanc d’œuf où il représente 7 à 8 % des protéines. Son pHi est de 11 (nettement supérieur à celui des autres protéines du blanc d’œuf) et son poids moléculaire est de 14600 Da.

3.2 Description de la procédure de purification du lyzozyme

Deux étapes de purification sont proposées pour obtenir un lysozyme purifié du blanc d’œuf

• Une chromatographie par échange d’ions (IEX) qui sépare les protéines en fonction de leur charge de surface nette. La colonne utilisée est une colonne échangeuse de cations faibles à carboxyméthyl (CM)
• Une chromatographie d’exclusion (SEC) qui sépare les molécules présentes, en fonction de leur rayon (taille) hydrodynamique. La colonne utilisée contient une résine Séphadex G-25 (fractionne jusqu’à 5000 Da)

3.3 Préparation de l’échantillon

• Peser le blanc d’un œuf et le transvaser quantitativement dans une fiole de 200 mL
• Compléter la fiole avec le tampon Tris-HCl (pH 8,5 - 0,1 M NaCl)
• Garder une fraction pour étude complémentaire (Tube SBO)

3.4 1ère étape de purification : Chromatographie IEX

• Préparer la colonne (voir 6.3 Démarrage)
• Monter la colonne HiTrap CM FF 5mL (voir 6. Consignes d’utilisation)
• Plonger les crépines dans les solvants respectifs
  (Solvant A = Tris-HCl pH8,5 à 0,1M NaCl ; Solvant B = Tampon pH8,5 à 1M de NaCl)
• Allumer le chromatographe
• Ouvrir le logiciel Unicorn® (System Control ; Evaluation) (voir 7. Utilisation unicorn)
• Sur System Control, connecter le chromatographe à Unicorn® en cliquant sur « Connect »
• Lancer la méthode en cliquant sur « Method Run », choisir « Lysozyme2 »
• Suivre les instructions à l’écran (le volume de blanc d’œuf à injecter est de 1 mL)
• Sur Évaluation, intégrer et éditer vos pics
• Garder la fraction la plus intéressante pour étude complémentaire (Tube P1)
• Re-conditionner la colonne (voir 6.4 Rinçage)

3.5 2ème étape de purification : Chromatographie SEC

• Préparer la colonne (voir 6.3 Démarrage)
• Changer de colonne, monter la colonne HiTrap Desalting 5mL (voir 6. Consignes d’utilisation)
• Plonger la crépine A dans de l’eau distillée
  (Remarque : la crépine B peut aussi plonger dans le même récipient que la A)
• Allumer le chromatographe
• Ouvrir le logiciel Unicorn® (System Control ; Évaluation) (voir 7. Utilisation unicorn)
• Sur System Control, connecter le chromatographe à Unicorn® en cliquant sur « Connect »
• Lancer la méthode en cliquant sur « Method Run », choisir « dessalage »
• Suivre les instructions à l’écran (le volume de fraction à injecter est de 1 mL)
• Sur Évaluation, intégrer et éditer vos pics
• Garder la fraction la plus intéressante pour étude complémentaire (Tube P2)
• Re-conditionner la colonne (voir 6.4 Rinçage)